HIV-1 p24 rekombinantes Antigen

Das humane Immunschwächevirus Typ 1 (HIV-1) ist die Hauptursache des erworbenen Immunschwächesyndroms (AIDS)[  ]. Die Diagnose einer HIV-Infektion, insbesondere die Früherkennung, ist ein wichtiger Teil der AIDS-Prävention und -Kontrolle[  ]. Das Gag-Protein von HIV-1, ein Polyprotein von 55 kDa, ist eines der am stärksten konservierten viralen Proteine. Das Gag-Protein wird durch eine virale Protease gespalten, um p17, p24 und p12 während der viralen Reifung freizusetzen[  ].

Das P24-Protein ist das wichtigste Kernprotein des Viruspartikels und wurde als spezifisches Ziel für antivirale Strategien vorgeschlagen[  ].

Das P24-Protein ist eines der Nachweisziele der meisten diagnostischen Kits. Der Nachweis des P24-Antigens ist auch hilfreich für die Früherkennung einer HIV-Infektion [ ]. Der Test der vierten Generation für HIV-Infektionen basiert auf dem Nachweis des p24-Antigens und ist in der Lage, HIV-Infizierte in einem frühen Stadium zu finden, was zu verkürzten diagnostischen Fenstern führt[  ]. Das p24-Protein kann auch als integraler Bestandteil jedes Mehrkomponenten-HIV-Impfstoffs verwendet werden [  ].

Ein geeignetes rekombinantes p24-Protein mit der gleichen antigenen Aktivität wie natürliches p24-Protein wäre für eine Reihe von Studien nützlich. Das p24-Protein wurde in einer Vielzahl von Systemen produziert, darunter Escherichia coli [ , Pichia pastoris [  ], pflanzliches Expressionssystem [  ], Baculovirus-Insektenzelle [  ] usw. In dieser Studie wurde ein rekombinantes Plasmid konstruiert, um das His-markierte p24-Protein in Escherichia coli zu exprimieren . Das Protein wurde in löslicher Form exprimiert und durch Ni 2+ gereinigt-NTA-Affinitätschromatographie. Enzyme-linked Immunosorbant Assay (ELISA) und Western-Blot-Analyse zeigten, dass die rekombinanten p24-Proteine ​​eine gute Immunreaktivität und Immunogenität aufwiesen.

Methoden

Stämme, Plasmide, Enzyme und Reagenzien

Die E. coli -Stämme DH5α und BL21(DE3) wurden für Klonierungsexperimente bzw. Proteinexpressionen verwendet. Beide Stämme wurden von Invitrogen (Novagen, Shanghai, China) gekauft. Plasmid pQE30 (Novagen, Darmstadt, Deutschland) wurde für die rekombinante Proteinexpression verwendet. Restriktionsenzyme, Taq-DNA-Polymerase und T4-Ligase wurden von TaKaRa Biotechnology Co. (Dalian, China) erworben.

Konstruktion des Plasmids, das das Protein p24 exprimiert

Der offene Leserahmen von HIV-1 p24 wurde aus dem Plasmid pHIV amplifiziert, das das Hybridgenom des HIV-1-Stamms NY5 und LAV enthält mit dem Vorwärtsprimer (5′-GA G GAT CC C CCA TAG TGC AGA ACC TC-3′ , BamH I-Stelle unterstrichen) und der Rückwärtsprimer (CC G GTA CC T TAG AAA ACT CTT GCT TTA TG-3′, Kpn I-Stelle unterstrichen). Das PCR-Produkt wurde mit BamH I und Kpn I verdaut und in das prokaryotische Expressions-pQE30 eingefügt, das mit den gleichen Enzymen verdaut wurde, um das p24-Expressionsplasmid pQE30-p24 zu erzeugen.

Expression des p24-Proteins

E.coli BL21, transformiert mit pQE30-p24, wurde in LB-Medium, ergänzt mit 50 μg/ml Ampicillin, für das Wachstum bei 37°C bis zur logarithmischen Phase (bei OD600 von 0,5–0,6) kultiviert und durch Isopropyl-β-D-Thiogalactosid ( IPTG) bei einer Endkonzentration von 1,0 mM für 12 h bei 20°C. Die Bakterienlysate wurden einer 15 % SDS-PAGE unterzogen, und die Bandscan5.0-Software wurde angewendet, um die Expression des Fusionsproteins zu bewerten.

Charakterisierung der Löslichkeit des p24-Proteins

Um die Löslichkeit des His-markierten p24-Proteins zu beurteilen, wurden Bakterienkulturen in logarithmischer Phase pelletiert und in 20 mM Tris-HCl-Lysepuffer (pH 8,0), ergänzt mit 100 mM NaCl, 1,0 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF), 50 mg/ml, suspendiert Lysozym und einer Beschallung auf Eis unterzogen, bis es klar ist. Die gesamten Bakterienproteine ​​wurden dann durch 20-minütige Zentrifugation bei 14.000 × g bei 4°C in lösliche und unlösliche Fraktionen aufgeteilt. Der Überstand (lösliche Fraktion) wurde gesammelt und die Pellets (unlösliche Fraktion), die die Einschlusskörper enthielten, in entionisiertem Wasser suspendiert. Beide Fraktionen wurden parallel durch 15 % SDS-PAGE analysiert, um die Löslichkeit des His-markierten p24-Proteins zu charakterisieren.

Reinigung des p24-Proteins

Der Überstand wurde durch eine 0,45-μm-Membran (Pall Corporation, USA) filtriert und dann auf eine mit 2 ml Ni 2+ -NTA-Harzaufschlämmung gepackte Gravitationsflusssäule (Qiagen, Deutschland) geladen. His-markierte p24-Fusionsproteine ​​wurden gemäß dem Handbuch des Herstellers für hochgradige Expression und Reinigung von 6 × His-markiertem Protein gereinigt, und die Ausbeute wurde unter Verwendung eines Coomassie-Protein-Assay-Kits (Biomed, China) quantifiziert. 15 % SDS-PAGE wurde durchgeführt, um die Identität zu validieren und die Reinheit des Zielfusionsproteins zu bewerten.

Identifizierung rekombinanter p24-Proteine

Um das Vorhandensein und die scheinbare Molekülmasse der in E. coli exprimierten rekombinanten Proteine ​​zu bestätigen , wurde ein Western Blot unter Verwendung von Anti-His-Antikörper (Sigma) durchgeführt. Das gereinigte rekombinante p24-Protein wurde durch 15 % SDS-PAGE getrennt, auf eine Nitrozellulosemembran (GE Healthcare, USA) elektrotransferiert und mit 5 % fettfreier Trockenmilch in TBS (50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 7,5) blockiert ) bei 37°C für 2 h. Nach dreimaligem Waschen (jeweils 5 min) mit TBS, das 0,05 % Tween-20 (TBST) enthielt, wurde die Membran mit Meerrettichperoxidase-konjugiertem monoklonalem Anti-His-Antikörper inkubiert. Immunreaktive Proteine ​​wurden dann unter Verwendung des ECL-Western-Blotting-Analysesystems (Pierce, Rockford, USA) sichtbar gemacht.

Immunreaktivitätsanalyse des rekombinanten p24-Proteins

Humanserumproben (n = 90) wurden vom PLA Center for HIV Test bezogen, darunter vierzig HIV-1-positive Proben und fünfzig HIV-1-negative Humanserumproben. Das Protein p24 (1,5 ug/ml in 200 nmol/l NaHCO 3 pH 9,8, 100 ul/Vertiefung) wurde auf ELISA-Platten (Nunc, Roskilde, Dänemark) bei 4°C über Nacht aufgetragen. Die Platten wurden dann bei 37°C für 3 h mit 5% fettfreier Milch blockiert und viermal mit PBST gewaschen. Humanseren wurden als primärer Antikörper (Verdünnung 1:50) bei 37°C für 1 h zugegeben. Die Platten wurden dann viermal mit PBST gewaschen und mit HRP-konjugiertem Ziegen-Anti-Mensch-IgG (Verdünnung 1:3000) bei 37°C für 1 Stunde inkubiert. Die Farbe wurde unter Verwendung von TMB-Lösung (Sigma) entwickelt und die Extinktion wurde unter Verwendung eines ELISA-Lesegeräts bei 450 nm untersucht.

Impfung und Nachweis von HIV-1 p24 spezifischen Antikörpern

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Drei weiblichen BALB/c-Mäusen, 8 Wochen alt (erworben vom Center of Experimental Animals, Academy of Military Medical Sciences, Peking) wurden intradermal auf Rücken und Abdomen 80 μg gereinigtes His-markiertes p24-Protein gemischt mit komplettem Freunds injiziert Adjuvans (100 μl pro Stelle). Präimmun-Mausseren wurden vor der Immunisierung gesammelt. Nach drei Immunisierungen innerhalb von 21 Tagen wurden diese immunisierten Mäuse getötet. Blutproben wurden gesammelt und 2 h bei 4°C stehen gelassen, und die Seren wurden nach Zentrifugation bei 4000 U/min für 10 min bei 4°C abgesaugt. Serumproben wurden seriell von 1:500 bis 1:8192000 verdünnt, und Anti-p24-Antikörpertiter wurden durch indirekten ELISA mit rekombinantem p24-Protein bestimmt. Western Blotting wurde mit kultivierten HIV-1-Extrakten durchgeführt, um die Antikörperspezifität nachzuweisen.

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